发布时间:17-05-03 14:50分类:技术文章 标签:PCR仪,我想问一下PCR仪有哪些种类,如何选购 摘要:PCR仪的种类有很多,据我所了解的大致有四种,普通的PCR仪、原位PCR仪、梯度PCR仪、实时荧光定量PCR仪,这些产品爱仪器仪表网上面都有卖的,如果你想购买PCR仪的话,我建议你不妨去爱仪器仪表网咨询下!PCR仪的种类分类总是五花八门,总体来说可以分为PCR扩增仪和实时荧光PCR仪两大类,有人也把它们称为半自动和全自动,或者定性和定量,都是比较不准确的称呼。PCR*重要的*是个升降温过程,*初的水浴锅式PCR,*是三个水浴箱,一个机械臂,定时抓出反应槽转换水浴锅。这种东东体积大,迅速慢,但其实结果并不比以后的PCR仪差,我现在都很欣赏。后来有人利用致冷和加热做成了,固定位置升降温的PCR扩增仪。后来随着定量技术的发展,有公司将扩增仪和检测做成一体,也*成了现在所谓的全自动(或定量)PCR仪。当然标准的叫实时荧光定量PCR仪。品牌什么东西都有品牌,现在国内国外PCR仪的品牌很多,*国外而言比较著名的有:ABI美国应用生物公司:老牌的生物公司贵族,其收购了原来的PE,而PE公司是PCR的鼻祖,旗下有很多经典的PCR仪,有5700(已停产)、7700(已停产)、7000、7900等实时荧光定量PCR仪。ROCHE罗氏诊断:炙手可热的新贵,LIGHTCYCLER是其*的PCR仪,市场做得很不错,以科研定位为主,但在国内很多医院使用,其很特色离心、气加热、毛细管等,设计另类,是*有特色的PCR仪,当然好坏另议,*单其另辟蹊径的技术能力和胆识*值的佩服。MJ:刚入中国的名流,MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名,其产品比较适合高通量检测,人类基因组计划用得很多。其实时荧光PCR仪刚进入中国不久,孔间能使用不同温度是其特色。这点其实比较有用。伯乐:呵,廉价的麦当劳,ICYCLER是其主打,进入中国已经比较久了,产品和5700一样,是扩增仪上加装定量模块而成,特点是价格较低。国内现在做的也很多,比如北京熙缜隆博环保科技有限公司等。选购准确的讲包括实时荧光定量在内都没有自动加样和标本处理系统,只能算半自动的。PCR仪是个简单的东东,一个温控设备和一个检测设备而已。关于温控,主要是介质问题。理想的介质是导热性好、比热大、接触紧密的东东。这方面*好的是水浴和油浴,比热大(油比水更大)、溶剂化物体,与反应物无缝接触,效果当然*好。但是自动化,小型化难,只有*初的水浴锅式使用。硅加热,这是使用*普遍的一种,优点:易自动化、速度快、直接加热降温,效果当然好,但是*成本较高,第二其使用的介质是金属,导热虽然好,但是与反应管,很难做到无缝接触,定性时代可以加油,但用荧光定*,由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。第三由于是底部加热,下部压力较大,有溢出的可能,不过新的仪器在加热盖以后解决了这个问题。空气加热,用空气做介质有优点,与反应体系无缝接触,但是空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动,增强导热性,同时使用毛细管,加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。但有的厂商把什么离心、毛细管的好处大讲特讲,对气加热的弱点闭口不谈,却是高明的市场手法。同时,使用离心,对标本量增大是有影响的并且标本量越大,空气比热小的弱点*越明显,所以空所加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大,吸附现象更大,因此试剂的通用性差一般要专门开发,成本高,虽然试剂用量少,但因为是专用试剂,每人份*是以实际量算,并不省试剂。反而增加了毛细管成本。关于功能,所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较*特,这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久,具体如何还不得而知。关于选购,根据单位情况而定,由于PCR的技术含量其实并不高,好的国产仪器如杭州博日(与日本著名厂商大和有关)也差不太多。关于进口仪器,罗氏的仪器不错,但如果标本量大,建议不要用罗氏。一则会累死的。另外,每个标本要分摊的标准曲线、对照成本太高。同时,试剂也比较受限。如果您想了解有关PCR仪的相关问题,可以直接登录www.ai1718.com网站,或者直接拨打爱仪器仪表网客服热线010-68940148,我们会真诚的为您服务的。

热盖――现在的PCR仪一般均配备热盖,热盖温度设为105℃,使样品管顶部的温度达到105℃左右,蒸发的反应液就不会产生凝集在管盖上而改变反应体积,这样用户就无需再向反应管内加石蜡油,直接减少后继反应的麻烦。如果是旋转加压的热盖就要特别小心,因为压力到达时没有明显的提示,用户需要根据经验将热盖旋到合适位置,不太容易掌握。如果过松,热盖没有充分接触反应管而影响结果;如果过紧,则会导致反应管变形,甚至可能造成热盖的机械故障。最新的ESP技术是指热盖加热时不接触样品管,避免加热样品管导致非特异产物,等加热到设定温度后热盖下降,将样品管压入加热模块,下降时间和压力都由电子控制。

模块控温是早期PCR仪所使用的控温方式,即所设定的温度为加热模块的温度,在变温过程中,快要达到目标温度时,PCR仪将升降温速率降低,让模块的温度慢慢接近目的温度,而不发生过冲。计算控温也称为管式控温,即考虑的是PCR反应管中的温度,为了加快使反应管中温度达到目的温度,模块温度先过冲,然后在反应管中温度接近达到目的温度时调节到合适的温度,调节方式是通过理论计算与实验相结合而来的,与反应管中的反应液的体积有关,因此计算控温模式都需要实验人员输入反应液的体积。计算控温模式已经是普遍采用的方式了。

PCR技术被广泛地应用于生命科学研究、食品卫生、医疗、法医及环境监测等诸多方面,包括科研、临床、用户试剂、进口试剂、定性或定量等各种条件要求的PCR实验。

品牌不是唯一,高性价比的荧光定量PCR仪选购指南从1996年ABI公司推出了全球第一款荧光定量PCR以来,经过10几年的发展,由于荧光定量PCR仪的在科研、检测和诊断领域的广泛应用,市场规模也不断扩大。已有多家国内外生产厂商涉足研发生产,就连Eppendorf公司也于2006年底推出了自己的荧光定量PCR仪。这些产品良莠不齐,令研究人员选择是不免挑花了眼。于是很多资金充足的实验室为了保险起见都选择购买了几家最有名气公司的产品,如ABI的7500和7900,罗氏的Lightcycler2.0,Lightcycler480,Eppendorfmastercycler等产品。但是这些名牌产品因为品牌溢价所以价格都高高在上,另很多经费不是很充足的实验室望而却步。这些产品的性能有大量文章做过比较,在这里就不做过多描述。但是品牌不是唯一,科研工作者更不应该迷信品牌,依靠自己真实的实验体会做的选择才是最准确的。下面综合大量的科研人员的实验体会着重向广大科研工作者介绍一些现在市场上高性价比的几款荧光定量PCR仪。进口篇1.Bio-rad伯乐在国际上属于中端品牌,在中国最初由于电泳系统被广大科研用户所熟知。伯乐的PCR产品线也比较丰富,收购MJRearch之后进一步丰富的PCR的产品线。目前伯乐的IQ5荧光定量PCR仪是一款性价比较高的产品,采用96孔Peltier半导体加热,5通道,12bitCCD检测,而且还带有梯度功能。售价也是远远低于ABI7500,所以这两年来用户较多。但有用户反应说这款仪器的检测灵敏度不太好,另外维修率比较高。实际情况大家还可以通过多咨询老用户进一步了解2.BIONEER国内的用户可能听说过这个品牌的不多,只有早期较多使用进口引物的实验室和研究所或留美学者知道这个品牌。Bioneer最初是以高通量的引物合成起家,引物合成在国际上有很高的知名度。后经10几年发展产品线已覆盖整个分子生物学领域,目前同takara的产品线几乎完全一样。BIONEER的普通梯度PCR仪的价格同其他进口设备的价位比较,很具有杀伤力。这家公司也于2006年底推出了荧光定量PCR仪ExicyclerTM96,产品技术参数也是采用96孔Peltier半导体加热,5通道,16bitCCD检测,也带有梯度功能。这款产品的参数几乎与Bio-rad的IQ5一模一样,而且检测的CCD像素还要高于IQ5,理论上检测灵敏度应该更好一些。产品价格据说还要比Bio-rad更低一些,号称是性价比最高的荧光定量PCR仪。但是缺点是现在国内用户很少,了解起来不太容易。有兴趣的客户可以联系他们的子公司柏业贸易有限公司进行试用,新公司都注重是售后服务,大家毕竟要亲身体会到才是最可靠的。3.StratageneStratagene现在为安捷伦公司的子公司,也是专著于分子生物学研究产品开发的公司。在国内它的试剂产品卖的不多,处于推广阶段。Stratagene的荧光定量PCR产品Mx3005P同以上两种产品技术参数也差不多96孔Peltier半导体加热,5通道,PMT检测器,但是没有梯度功能,用户不能在这台仪器上优化反应条件。另外有客户反应该仪器做工较粗糙,噪音比较大,而且边缘的孔做实验的效果不太好,但是只要使用热模块中间的孔做实验效果还是不错的。这样的问题问题在ABI7500仪器上也同样存在,但是Stratagene的价格要实惠很多。国产篇现在国内的生命科学研究市场基本上是被国外的跨国公司所垄断,国内的厂商只能靠底价来占领一小部分市场,平心而论国内的厂商在技术和工艺上面确实和国外厂商有一定的差距。但这也是由于我国的基础研究水平和制造工艺起步都比较晚的客观原因造成的,再加上国内厂商的经营和财力等问题,所能提供的员工待遇与跨国公司也有一定的差距,所能吸引的人才也受到限制。有国内生产仪器公司的老总就直言不讳的提出,他们暂时还没有能力请国际一流的设计师和改进生产工艺的能力,只能是靠低价来占领一部分市场待原始积累达到一定程度之后再改进产品争取进入更高一个级别的市场中。当然我们也看到国内的厂商也是在不断的进步之中,随着越来越多的一流人才加入到生物技术领域中,相信生物技术市场也会像当年的家电市场一样慢慢的将国外厂商的垄断局面打破并夺回大部分的市场。下面就介绍几款国内厂商生产的荧光定量PCR仪1.杭州博日提到国产PCR仪就不得不提到杭州博日公司,和Takara一样属于日本在华投资较早的生物技术企业。博日公司一度在低端PCR仪领域占领了很大的市场,虽然近年来随着其他国产品牌的冲击,市场占有率已经严重下降,但是总体上还是处于领先的水平。该公司的荧光定量PCR仪产品FQD-48A是4通道,48孔Peltier半导体加热。相对于前面介绍的几款进口产品相比较样品通量和检测光路均较低,但也可以满足实验样本不是很大的用户使用。而且博日产品的价格比前面介绍的几款进口产品的价格也要更低一些。2.西安天隆西安天隆的荧光定量PCR产品TL988是一款真正的依靠国内自主研发而成多通道荧光定量PCR仪,TL988设计比较灵活,可选36孔与96孔加热模块,但通道和多通道几种组合模式。最多可达5通道,但不足之处是还是使用单激发虑光片,激发光特异性不好,导致检测灵敏度较低。据了解在国内的医疗系统还是一些用户,科研系统的用户比较少。3.上海宏石上海宏石生产的SLAN实时荧光定量PCR是一款在国内市场反应不错的仪器,在国产荧光定量PCR仪的性能比较中是属于检测灵敏度和重复性最受认可的仪器。不足之处是光路通道和样品孔数量比较小。最大只有三通道和48个样品孔的机型,不能满足较大样品量的客户需求。目前在医院临床检验科中是国产荧光定量PCR仪销量最高的仪器,在科研系统用户比较少。小节:目前大部分的市场份额还是被国外厂商所占领,尤其是在科研,CDC和血站等系统,国外厂商更是处于垄断地位。但是目前国内的厂商也在医院临床检验系统占有一席之地。科研人员和医疗工作者还是要根据自己的实际需求和亲身体会做出选择,“选对的,不选贵的”这句名言用于购买荧光定量PCR仪也同样适用。

在PCR仪上增加原位PCR模块就可以在玻片上进行原位PCR扩增,MJ和eppendorf的PCR仪都有提供原位适配器以满足不同需要。购买配有支持原位PCR模块的PCR仪对从事医学研究的工作者是很值得的,一机两用。

常见几种PCR仪分类

PCR仪即基因扩增仪,主要是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。其原理为利用升温使DNA变性,用限制性内切酶使DNA双链解链,在聚合酶的作用下使单链复制成双链,进而达到基因复制的目的。

二、仪器的功能性和人性化设计 当然是越简单方便的设计最符合用户的要求。

还有一个很重要的因素不在仪器的性能之内,就是厂家或代理商的售后服务承诺及服务能力,如保养服务、元件级维修能力等。这是使用者都明白的,但有时仪器采购人员过多注重于表面价格,其实应该将隐性的成本考虑在内。

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作为用户来说,当然更愿意选择升降温速度快的,这就像汽车上好看的表面配置一样容易看到,而内在的稳定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必须注意到,仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事,因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。

PCR仪的一些主要需要考虑的因素做简单的说明:

PCR仪的反应,主要是先将DNA加热变性, 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板。 再将Primers冷却至55~60℃,附着于模板DNA两端,最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下加热,进行引物的延长及DNA的合成。

核心提示:1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法,1976年一种从嗜热水生菌分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和 Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文,Mullis当时服务于Perkin Elmer公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。后来PE被Applied Biosystems Inc.公司收购、分拆、再转卖,而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。到如今,PCR方法愈发趋向自动化,并从中衍生出更多的新技术方法,可以说,PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场,多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。PCR的专利目前依然掌握在ABI和Roche两大公司手中,去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。

7、 软件功能:

PCR仪目前按照扩增的目的和检测的标准,主要分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪等。普通PCR仪要做不同的退火温度需要多次运行,梯度PCR仪可以设置一系列不同的退火温度条件,通常有12种温度梯度进行扩增。原位PCR仪用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。实时荧光定量PCR仪增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。

软件――新的PCR仪都比较注重程序编写的简易性。大屏幕,显示实时信息,倒计时,记忆存储多个程序、自动断电保护等都有助于实验室中的复杂环境使用。程序储存方面,有人觉得储存程序的多少似乎意义不太大,但是对于实验人员多、PCR仪每天运作频繁的实验室来说,每个使用者独立储存自定义的PCR程序,确实能方便下一次的调用,会节约一些时间。

3.仪器外表面的清洗清洗仪器的外表面可以除去灰尘和油脂,但达不到消毒的效果。选择没有腐蚀性的清洗剂对PCR仪的外表面进行清洗。

标签: PCR仪 扩增仪 基因扩增仪

此外,随着基因组高通量研究的需求的提高,各品牌都推出了多槽式高通量PCR仪,各有特长:MJ有一种一拖四,就是1个主机带4个扩增槽,每个槽可以独立控温,一次可以作 96x4个样品的PCR,不过一旦出现问题4个都不能用了。ABI则在原来的9700的基础上推出了双384孔的基座,一次完成384x2个样品,使得 9700的功能又扩展到高通量领域而无需购买新的机器,可惜两个384槽不能独立控温。eppendorf则有一个控制面板,可以控制5个独立的PCR 仪,每台机器可以联合,而且互不影响,但是比较浪费空间。

普通PCR仪

温度控制除了精确度,还有一个厂家喜欢大力宣传的指标――升降温的速度。更快的升降温速度,可以缩短反应进行的时间,而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间,能提高PCR反应煌特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温更快速的半导体。除了机械本身的原因,影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。例如ABI早就有升降温速度高达5°C的黄金基座,最近eppendorf也推出了升降温速度可达到6℃/秒和4.5/秒的银质模块,是目前同类产品中升降温速度最快的,据厂家资料,一个在其他仪器上原本需要需要40―60分钟的PCR反应,eppendorf Mastercycler ep只需运行28分钟――别小看这节约下来的几十分钟,一天下来就可以多运行好几轮了。而真正常用而经济的材料是铝合金。

3.PCR反应过程的关键是升、降温过程的时间控制,要求越短越好,当PCR仪的降温过程超过60s,就应该检查仪器的制冷系统,对风冷制冷的PCR仪要较彻底地清理反应底座的灰尘;对其他制冷系统应检查相关的制冷部件。

有的PCR仪厂家推出了另一种温控方式;热敏电极温控模式。该方法将一个热敏电极插入一个专门的测量管中,反应进行时,将该测量管插入温控模块的样品进行检测。他们认为通过此途径可以监测反应管内样品的实际温度,但这种方法未免有些华而不实;测量管中矿物油的温度变化与实际反应样品的温度变化未必一致;因为测量管必须占用一个样品孔,所以使用该温控方式时就无法使用96孔PCR板作实验。

实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。

温度的均匀性是指样品孔间的温度差异,它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用同样的样品,同样的PCR反应程序,最后的结果竟然差异非常明显,或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔,就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论,PCR仪的温度均匀性不好,特别是最外周的样品孔情况更差,很有可能影响实验结果――即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响更为明显,所以后来才有Roche和Cobbett的离心式定量PCR的重大创新。

8、 使用寿命:

对于一个PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算最适的退火温度,可是由于模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能"P"出来结果,细微的变化对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题 ――在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在指定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出最适合的反应条件。不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化――对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的最佳反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。多次实验可在一台仪器上完成,既节省实验时间提高效率,又节省实验成本。

这是一个很实际的问题,大多数PCR仪都只保修一年,有些在用户的要求下会增加保修时间。一般仪器的保修费用为仪器价格的8-12%每年,所以保修也就是钱。一般来讲进口仪器的维修成本会比较高,一是配件成本本身就高,二是运输费用及进口关税等。另外进口仪器厂家一般都不允许进行原件级的维修,是出于利润以及质量两方面的考虑,其实国外元件级维修的成本也许比更换电路板成本还高。因此只有国内人员才进行元件级的维修,国内人力成本低,水平也高些。

梯度PCR

梯度PCR仪

现在的PCR仪如ABI,Eppendorf的一般具有两种温控模式,即模块温控模式(Block-control)和反应管温控模式)(tube- control)。在模块温控模式下,机器根据探测器直接探测的温控模块(即承载样品的金属台)的温度进行控制,这种模式适用于长时间的静态孵育(如连接、酶切、去磷酸化等)。反应管温控模式实际上是一种模拟试管/PCR板的温控模式,根据探测器所探测到的温控模块的温度由计算机计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来,试管温控更为准确,因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。特别是PCR反应中的孵育过程一般都很短暂,如果采用只有模块温控模式的话,反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。而反应管控制精确的算法能自动补偿时间,而且适合各种类型的反应管,确保反应混俣物按照程序设定的时间维持预设温度。这里要表扬的是ABI――因为他们的宣传资料很老实的指出,模块升降温速度高达 3.5℃,样品的实际平均升降温度是1℃左右,而且ABI的PCR仪中显示的温度也是计算出来的样品温度而非温控模块的温度。我们看到过有的品牌代理做的宣传资料中故意引用ABI的“样品实际平均升降温速度”去和自己的模块升温速度比较,未免有失公允

即不同列或不同行之间温度可以为不同的温度。这一功能对于固定PCR程序的检验人员来讲,可能用处不大,但对于经常进行不同基因扩增的研究人员来讲可以说是必须的。